[提要]本研究利用基因重组技术，构建并表达吉布森巴贝斯虫的重组顶膜抗原-1(BgAMA-1)，将BgAMA-1作为诊断抗原，建立针对吉布森巴贝斯虫的ELISA诊断方法。结果显示，构建的重组表达质粒得以表达，建立的ELISA方法在血清学诊断中有较好的特异性。 [关键词] 吉布森巴贝斯虫；顶膜抗原－1; ELISA

犬焦虫病的是一种以蜱作为传播媒介，由犬巴贝斯虫和吉布森巴贝斯虫两类病原体引起的血液原虫病[1]。尤其是吉布森巴贝斯虫，具有超强毒力，能引起感染狗发烧、渐进性贫血、血红蛋白尿，解剖可见脾、肝肿大，严重时常导致死亡，对狗的危害相当严重，且其流行广泛，包括亚洲、非洲、欧洲以及美洲的许多地区都有报道[2,3]。近几年，随着人们生活方式的改变，宠物狗渐渐增多，焦虫病的发生也越来越多见，已成为临床的一种常见病。特别是当对狗进行手术或免疫抑制药物治疗时，易诱发本病。因此，犬焦虫病已给人们的生活带来了一定的影响，应引起重视。
用于诊断用的重组抗原物质近年来也有报道，其中重组抗原P50，在用作吉布森巴贝斯感染的血清学诊断实验中，表现出特异性高、敏感性强的优点[4]。另外，最近从吉布森巴贝斯虫中找到一种抗原成分，经过分析，被确定为顶膜抗原-1。顶膜抗原-1是顶复门类寄生虫所特有的一种分泌抗原，由虫体顶体部分的细胞器所分泌，在协助虫体入侵宿主细胞的过程中扮演了重要角色，已证明是一种具有很好免疫原性的蛋白[5、6]。本研究利用重组顶膜抗原-1建立了吉布森巴贝斯虫的ELISA诊断实验。

材料与方法
1.1 材料
1.1 实验动物和虫体来源：SPF毕尔格猎犬由日本北海道国家原虫病研究中心提供，NRCPD系的吉布森巴贝斯虫由日本北海道国家原虫病研究中心提供。
1.2主要试剂：Taq DNA聚合酶购自日本Biosystems Foster city Calif, 引物均购自日本 SIGMA公司， GENECLEAN Ⅱ KIT DNA纯化试剂盒购自日本Q.BIO.gene公司，TOPO TA CLONING KIT DNA连接试剂盒购自日本Invitrogen公司，QIAprep Spin Miniprep Kit DNA提取试剂盒购自头美国QIAGEN公司， pGEX-4T-3质粒购自日本Pharmacia Biotech公司，Glueathione Sepharose? 4B谷胱甘肽纯化试剂盒购自日本Amersham Biosciences公司。
1.3 血清: 实验过程中所使用的血清均由本实验室提供。其中B.gibsoni感染犬血清样20份, B.canis canis感染犬血清样5份,B.canis rossi感染犬血清样2份, B.canis vogeli感染犬血清样3份。
2 方法
2.1 重组表达质粒pGEX-4T-3/BgAMA-1的构建：为构建重组表达质粒，设计了一个带EcoRI酶切位点的正向引物AMA-E-F1和一个带Xho I酶切位点的反向引物AMA-E-R1。扩增参数设为94℃ 5 min,94℃ 1 min,56℃ 1 min, 72℃ 2.5 min,35个循环后, 72℃ 7 min。用限制性内切酶EcoRI和Xho I对经GENECLEAN Ⅱ KIT回收纯化的PCR产物和表达载体pGEX-4T-3分别进行双酶切，回收纯化后，在T4 DNA连接酶作用下连接，重组子转化大肠埃希菌DH5α。将转化的大肠埃希菌DH5α涂于LB平板培养基（含50 mg/L氨苄青霉素）中，37℃倒置培养过夜。挑起菌落接种于LB液体培养基（含50 mg/L氨苄青霉素）中，取少量菌液，作为PCR反应的模板，进行阳性克隆鉴定。用阳性重组质粒再次转化大肠埃希菌BL21,同样方法进行阳性菌落鉴定。
2.2 重组抗原的表达及纯化 参照文献[4]方法进行。
2.3 ELISA检测
纯化后的GST-BgAMA-1重组蛋白和对照GST蛋白，分别用缓冲液稀释到2. 5μg /ml，在96孔的平板中，加入50 μl／孔稀释液，4℃包被过夜；PBST（含0.05% Tween 100 的PBS）洗板1次，加入100 μl／孔的封阻液（含3％脱脂奶粉的PBS）,37 ℃作用1 h。PBST洗板1次，加入稀释的狗血清，37 ℃作用1 h, PBST反复洗板6次，以除去多余的未结合的反应成分，加入1∶4 000 稀释的辣根过氧货物酶(HRP)标记的二抗50 μl/孔（羊抗狗血清），37 ℃下作用1 h；6次洗板后，加入100μl／孔底物0.3 mg/ml 2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS), 0.003% H2O2，常温下避光作用1 h，用分光光度计检测吸光度（A415值）。
结 果
1 重组顶膜抗原-1的表达及纯化 重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21后，在诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的作用下，诱导表达GST-BgAMA-1融合蛋白。经过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析后。结果表明，重组顶膜抗原-1成功得到表达。 2 ELISA试验结果
通过ELISA方法评价重组的BgAMA-1在B.gibsoni感染狗的血清学诊断上的应用价值。所有B.gibsoni感染狗血清均呈阳性反应，而非B.gibsoni感染狗的血清都呈阴性（这些血清来自SPF狗，B.canis canis, B.canis rossi, B. canis vogeli以及鼠的T.gondii血清）(图2)。另外,人工感染B.gibsoni狗系列血清的ELISA结果显示，感染后的第18天，A415值最大，显示反应最强烈，感染后的第207天，当虫血症水平很低（几乎检测不到虫体），也能用ELISA方法检测到抗体反应。
3 ELISA的血清学结果 以吉布森巴贝斯虫的P50抗原作为阳性对照，用BgAMA-1建立的ELISA方法检测70份犬血清样品，诊断结果表明，用BgAMA-1作为诊断抗原与P50的结果具有较高的一致性，70份血清样中，P50的阳性率是14％，而BgAMA-1的是10％。
讨 论
在寄生虫与宿主相互作用的过程中，虫体的表面抗原往往是刺激机体引起免疫反应主要抗原物质。这类抗原一般具有良好的免疫原性，是疫苗研究和建立血清学诊断方法所依据的主要候选抗原。顶膜抗原-1就是这样一种表面抗原，它是顶复门类寄生虫所特有的表面抗原物质，由虫体顶体部位的细胞器所分泌。为了获得顶膜抗原-1，通过基因克隆的方法来构建顶膜抗原-1的重组表达质粒，以融合蛋白的形式在大肠埃希菌BL21进行表达，纯化后作为ELISA试验的反应抗原。用ELISA方法对收集来的犬血清进行了检测试验中，结果表明，ELISA不仅能够诊断出阳性和阴性感染，而且与其它Babesia属的虫体没有出现交叉反应现象。这说明BgAMA-1是一种B.gibsoni特异性抗原，且在诊断方面具有很好的应用前景。此外，在不同感染时期系列血清样的ELISA诊断实验中，也能检测到特异性的抗体反应。但是，研究发现，最强抗体反应出现得较迟（感染后的第18 d），这说明，BgAMA-1作为一种早期的诊断试剂还存在着一些的不足。这也可能就是在作血清学调查中，P50的检出率高于顶膜抗原-1的原因，P50检出为阳性，而顶膜抗原-1却是阴性反应的样品，可能是在感染的早期采到的血样，因而，与顶膜抗原-1在ELISA反应中不明显。但总之，用顶膜抗原-1作为ELISA诊断抗原也反应出较高的特异性和灵敏性，可用于吉布森巴贝斯虫的诊断，具有一定的临床应用价值。且重组抗原在生产上相对容易，稳定，质量上有保证。